遗传毒性试验 - Ames试验步骤

仪器和设备

培养箱、恒温水浴、振荡水浴摇床、压力蒸汽消毒器、干热烤箱、低温冰箱(-80℃)或液氮生物容器、普通冰箱、天平(精密度0.1g和0.0001g)、混匀振荡器、匀浆器、菌落计数器、低温高速离心机，玻璃器皿等。

实验材料

标准试验菌株(配套菌株)：有四种

TA98、TA97：检测移码突变

TA100：检测碱基置换突变

TA102：对醛、过氧化物及DNA交联剂较敏感

实验步骤

1.准备好经无菌处理过的（0.22微米）待测发酵液。

2.配置好底层培养基（VS、GS培养基加水溶解并灭菌），加入到无菌培养皿中，做好标记，混匀、静置凝固。

3.实验当天配置顶层培养基，融化顶层培养基分装于无菌小试管，每管2mL，在45℃水浴中保温。

4.用无菌蒸馏水溶解S9复合物并配制S9反应混合液。

5.在保温的顶层培养基中依次加入测试菌株菌液0.1mL，混匀；加受试物0.05mL~0.2mL（一般加入0.1mL。需活化时另外再加入10%S9反应混合液0.5mL），再混匀，然后迅速倾入底层培养基上。转动平皿，使顶层培养基均匀分布在底层上，静置凝固，37℃培养48 h观察结果（实验室温度低时倾倒的顶层培养基易冷凝，可将底层培养基放置于37℃培养箱一段时间，然后再倾倒顶层培养基）。

6.同理制作空白对照、溶剂对照和阳性对照，均包括加S9和不加S9两种情况。

7.以直接计数培养基上长出回变菌落数的多少而定，如在背景生长良好条件下，受试物组回变菌落数是溶剂对照回变菌落数的两倍或两倍以上，并有剂量反应关系或至少某一测试点有可重复的并有统计学意义的阳性反应，即可认为该受试物诱变试验阳性。受试物经上述四个试验菌株测定后，只要有一个试验菌株，无论在加S9或未加S9条件下为阳性，均可报告该受试物对鼠伤寒沙门氏菌为致突变阳性。如果受试物经四个试验菌株检测后，无论加S9和未加S9均为阴性，则可报告该受试物为致突变阴性。

8.试验结果照相。

试剂盒使用操作流程

1.实验器材、试剂准备：三角瓶、5mL或15mL试管、100μl和1000μl枪头、0.22μm滤膜、注射器、平皿、二甲基亚砜、灭菌蒸馏水等。

2.设置待测物剂量，配制各剂量无菌待测物溶液。

3.VS、GS培养基加水溶解并灭菌，配制底层培养基。

4.HB球加灭菌蒸馏水溶解，充分混匀，然后过滤除菌。

5.实验当天配制顶层培养基，2ml分装，然后45℃水浴保温。

6.用无菌蒸馏水溶解S9复合物并配制S9反应混合液。

7.开展Ames实验，将2mL顶层培养基+100μL菌液+100μL待测。

物或阳性底物+500μL10% S9混合液混匀，倾倒于底层培养基。

（实验室温度低时倾倒的顶层培养基易冷凝，可将底层培养基放置于37℃培养箱一段时间，然后再倾倒顶层培养基）；48h℃培养箱，培养37待顶层培养基冷凝后，将实验平皿放入。

8.实验过程。

9.准备好经无菌处理过的（0.22微米）待测发酵液。

10.配置好底层培养基（VS、GS培养基加水溶解并灭菌），放入50℃水浴保温。

11.实验当天配置顶层培养基，2ml分装，然后45℃水浴保温。

12.用无菌蒸馏水溶解S9复合物并配制S9反应混合液。

13.将2mL顶层培养基+100μL菌液+100μL待测物或阳性底物+500μL10%S9混合液混匀，倾倒于底层培养基（实验室温度低时倾倒的顶层培养基易冷凝，可将底层培养基放置于37℃培养箱一段时间，然后再倾倒顶层培养基）。

14.在每支上层培养基中分别加入。

15.活化好的鼠伤寒沙门氏菌TA98菌株菌液0.1ml以手指搓动试管使均匀后迅速导入底层平板中，放平培养皿待琼脂凝固。

16.用镊子在每个平皿中心放入厚的圆的滤纸片。