GLP认证咨询-药物遗传毒性研究技术指导原则（试验结果评价与追加研究策略）

四、试验结果评价与追加研究策略

       遗传毒性研究是药物安全性评价与药物整体开发进程的一 个重要组成部分，其最终目的在于预测受试物潜在的致癌性或其 他遗传危害性。试验结果的分析与评价是试验的必要组成部分， 应对研究结果进行科学和全面的分析与评价。在对遗传毒性试验 结果进行评价时，应结合受试物的药学特点、药效学、药代动力 学和其他毒理学研究的结果等信息进行综合分析。试验结果的评 价最终应落实到临床试验受试者范围限定、风险效益评估以及必 要防治措施的制定和应用上。

       遗传毒性试验组合检测的是主要通过直接的遗传损伤机制 的致癌物质(如绝大多数已知的人类致癌剂)，不适用于检测非 遗传毒性致癌剂。每种试验系统均可能产生假阴性或假阳性结 果。一些试验条件， 如有限的体外代谢活化能力， 可能导致体外 试验出现假阴性结果。试验组合方法的设计是为了减少具有潜在 遗传毒性的受试物产生假阴性结果的风险。另一方面， 任何一项 遗传毒性试验中的阳性结果并不一定能说明受试物对人类真正 具有遗传毒性或致癌性的危险。在对体内外试验结果进行评价时，对阳性或阴性的结果均应予以充分考虑， 尤其是在有疑问时。

       评价受试物的潜在遗传毒性时，应全面考虑各项试验结果、 体内和体外试验方法的内在价值及其局限性，进行综合分析与评 价。

(一)体外试验结果的评价

1.体外试验阳性结果

1.1  体外细菌回复突变试验阳性结果的评价

       由于细菌回复突变试验的阳性结果提示 DNA 反应性， 为评 估对患者用药的潜在风险，需进行充分的追加试验以评价体内致 突变和潜在致癌性，除非通过恰当的风险获益分析证明是合理 的。

       细菌回复突变试验出现阳性结果， 应考虑受试物的纯度，以 确定阳性结果是否污染物所致。氨基酸(组氨酸或色氨酸)污染 可能导致菌落数的升高而出现假阳性结果，因此细菌回复突变试 验不适合检测可能会降解的肽类。一些特殊情况下，细菌回复突 变试验阳性结果并不提示对人体有遗传毒性潜力，例如当发生细 菌特异性代谢时(如通过细菌硝基还原酶活化)。

1.2  体外哺乳动物细胞试验阳性结果的评价

       对于体外哺乳动物细胞试验阳性结果，应采用下述的证据权 重法进行分析，必要时进行追加试验。例如(包括但不限于)： ①阳性结果是否归因于体内不存在的条件(如 pH 值、渗透压、 沉淀物)；②阳性结果仅发生于产生最高细胞毒性的浓度：在小 鼠 淋 巴瘤 细 胞试 验 中 阳 性 结果发 生 于相 对 总 细 胞 生长 率 (Relative total growth ，RTG) 减少≥80%时； 在体外细胞遗传学 试验中阳性结果发生于细胞生长抑制≥50%时。

       对于以上情况，如果应用证据权重法分析提示缺乏潜在遗传 毒性，可采用标准试验组合一，即一个体内试验即可。

2.体外试验阴性结果

        对于体外试验阴性结果，在一些特殊情况下需考虑进行进一 步的试验，例如(包括但不限于)：受试物的化学结构或已知代 谢特征提示标准的体外代谢活化技术(如啮齿类动物肝脏 S9) 可能不适用；受试物的化学结构或已知活性提示采用其他试验方 法或系统更合适。

(二)体内试验结果的评价

       与体外试验相比，体内试验方法具有考虑到与人体应用相关 的吸收、分布、排泄的优点，而且体内代谢相对于体外试验中的 代谢系统更具有相关性。因此，体内试验在遗传毒性试验中具有 更重要的意义。

        如果体外与体内试验的结果不一致，对其结果差异应采用具 体问题具体分析的原则进行分析与评价， 如代谢差异、受试物在 体内快速和高效排泄等。

1.体内试验阴性结果

       体内试验结果的意义与受试物在靶组织(注释 5) 中是否有 足够的暴露直接相关，尤其是当体外试验为确定的阳性结果而体 内试验结果为阴性时，或者是当未进行体外哺乳动物细胞试验时 更为重要。受试物在靶组织中具有足够暴露的证据包括可疑组织 的毒性， 或下述的毒代动力学资料。如果受试物在靶组织中无法 达到足够的暴露量，则常规的体内遗传毒性试验的意义较小。

         对于体外遗传毒性试验结果为阳性(或未进行)而体内试验 结果为阴性的受试物，应采用以下任何一种方法来反映受试物在体内/靶组织的暴露水平：

( 1 )细胞毒性

        对于细胞遗传学试验，可通过微核试验中各剂量组和各采样 时间点所用组织(骨髓或外周血)中未成熟红细胞数与红细胞总数的比例的显著变化，或通过染色体畸变试验中有丝分裂指数的 显著降低，来间接反映受试物的暴露水平。

        对其他体内遗传毒性试验， 可通过肝脏或组织的毒性(如通 过组织病理学检查或血液生化学指标)来间接反映受试物的暴露 水平。

(2)暴露

        通过测定血液或血浆中的受试物相关物质水平来反映受试 物的体内暴露(注释 12)；直接测定靶组织中的受试物相关物质； 或通过放射自显影检测组织暴露水平。

        体内暴露的评估应采用与遗传毒性试验相同的动物种属、品 系和给药途径， 在最高剂量或其他相关剂量中进行。

        如果全身暴露与预期的临床暴露相似或更低，提示可能需要 采用替代的方法，如采用不同的给药途径、采用具有更高暴露的 不同种属、采用不同的组织或试验。

        若体外试验未显示受试物有潜在遗传毒性，可采用上述任何 一种方法，也可用啮齿类动物吸收、分布、代谢和排泄试验结果 来确定体内暴露水平。

2.体内试验阳性结果

       体内遗传毒性试验也可能出现假阳性结果， 例如：未给予任 何遗传毒性物质，但由于干扰了红细胞生成而导致微核升高； DNA 加合物数据应根据内源性加合物的已知背景水平进行解释 分析； 与毒性相关的间接作用可能影响 DNA 链断裂试验(如彗 星试验和碱洗脱试验)的结果。因此评价遗传毒性数据时应考虑 所有的毒理学和血液学发现(注释 13)。与毒理学改变相关的间 接作用可能有一个安全范围， 且可能不具有临床相关性。

(三)阳性结果追加研究策略

1.对体外哺乳动物细胞试验阳性结果的追加

以下讨论基于细菌回复突变试验结果为阴性。

1.1  追加机制/体内试验

       体外哺乳动物细胞试验为阳性结果且无充分证据以排除生 物学相关性时， 建议进行追加试验以提供试验证据。可进行附加 的体外试验或进行两种合适的体内试验，具体如下：

( 1 )进行附加的体外试验。

       体外试验可为阳性结果缺乏生物学相关性提供机制信息，如 小鼠淋巴瘤细胞试验中诱导染色体畸变或突变的受试物不是 DNA 损伤性物质的证据(如：除细菌回复突变试验外的其他突 变/DNA  损伤试验结果为阴性；化学结构上的考虑)，或者体内 可能不相关或可能具有阈值的间接机制的证据(如抑制DNA 合 成、仅在高浓度时产生活性氧簇等)。体外微核试验阳性结果的 追加试验也可采用类似的试验，或者证据还可包含提示染色体丢 失/非整倍体的已知机制、着丝点染色试验(注释 14)提示染色 体丢失。多倍体是体外染色体畸变试验中的一种常见现象。虽然 非整倍体剂可诱导多倍体产生，但仅多倍体产生并不能提示受试 物具有诱导非整倍体的潜力，而可能仅提示细胞周期紊乱；多倍 体也常常与细胞毒性的升高有关。如果在体外试验中仅见多倍 体， 而未见结构上的染色体断裂， 一个确保具有合适暴露的体内 微核试验的阴性结果，通常可提供不具有潜在非整倍体诱导作用 的充分证据。

       如果上述机制信息和证据权重分析支持受试物不具有相关 的遗传毒性， 仅需要一个具有合适暴露证据的体内试验，以确定 受试物不具有遗传毒性作用。通常采用体内细胞遗传学试验， 而 且， 当对潜在染色体丢失进行追加研究时要求进行体内微核试 验。

(2)进行两项合适的体内试验，通常采用不同的组织，并有支持暴露的证据。

        如果无充分的证据或机制信息以排除相关的潜在遗传毒性， 通常要求进行两项体内试验，需要采用合适的终点指标和合适的 组织(通常是两种不同组织)，且应在体内获得充分的暴露。

       终点指标充分合理并且证明有暴露的合适的体内试验的阴 性结果， 足以证明受试物不具有遗传毒性风险。

1.2  依赖于 S9 的体外试验阳性结果的追加

        当阳性结果仅见于 S9 代谢活化条件下，首先应确认是否是 代谢活化的原因而非其他一些不同条件(如，与非代谢活化培养 条件下的≥10%血清浓度相比，S9  混合物中血清浓度低或无血 清)。因此追加策略的目的是确定体外结果与体内条件的相关性， 通常采用肝脏体内试验(注释 15 )。

2.对体内微核试验阳性结果的追加

       若体内微核升高，应对所有的毒理学资料进行评价，以确定 是否是由于非遗传毒性作用所致或非遗传毒性作用是其中的一 个作用因素。如果怀疑存在干扰红细胞生成作用或生理学的非特 异性因素(如体温偏低或过高)，进行一项体内染色体畸变试验 更为合适。如果怀疑一个升高的结果， 应进行研究以证明该升高 是否是由于染色体丢失或染色体断裂所致(注释 14)。有证据显 示非整倍体诱导作用，如纺锤体抑制剂， 具有非线性剂量反应关 系。因此，可能可确定该作用是否有阈值暴露(低于该暴露下预 期不会有染色体丢失)，以及确定与临床暴露比较是否存在合适 的安全范围。

        总之， 受试物潜在遗传毒性的评价应考虑所有结果，并认识 到体外与体内试验各自的内在价值及局限性。

(四)与致癌性试验的肿瘤发现有关的追加遗传毒性试验

       在遗传毒性标准试验组合中呈阴性结果，但在致癌性试验中显示肿瘤发生率升高，而且无充分证据确定是非遗传毒性作用机 制的受试物， 应在合适的模型上进行附加的遗传毒性试验。为了 帮助了解作用方式，附加试验可包括改变体外试验的代谢活化条 件，或包括测定肿瘤诱导靶器官遗传学损伤的体内试验，如 DNA 链断裂试验(如彗星试验或碱洗脱试验)、DNA 加合试验(如通 过 32P-后标记)、转基因突变诱导试验，或肿瘤相关基因遗传学 改变的分子特征性分析。

(五)综合分析与评价

       当遗传毒性试验结果为阳性时，对进入临床试验是否安全， 应考虑所有的安全性资料，包括对所有遗传毒性资料的全面评 价，以及拟进行的临床试验的性质。

        对于遗传毒性试验出现阳性结果、但不直接与 DNA 发生作 用的受试物， 不全都会带来明显的体内给药的风险。因此，当遗 传毒性试验出现阳性结果时，建议提供有关遗传毒性机制的证据 以及这种机制与预期体内暴露的相关性，或者通过试验排除为直 接与 DNA 作用的机制，如证明受试物不使 DNA 烷化或DNA 链 断裂， 并提供未观察到遗传毒性的剂量水平。若确认受试物可直 接损伤 DNA，在极特殊情况下， 可能会被允许用于危及生命的 疾病(如晚期癌症)，但不能在健康受试者中使用。

五、参考文献

1.ICH.  S2(R1)：Guidance  on  genotoxicity  testing  and  data interpretation for pharmaceuticals intended for human use. 2011

2. 2.ICH. M3 (R2): Non-clinicalsafety studies for the conduct of human     clinical     trials     and     marketing     authorization     for pharmaceuticals. 2009

3.FDA. Guidance for industry and review staff: Recommended approaches to integration of genetic toxicology study results. 2006

4.OECD. Guideline for testing of chemicals No.471：  Bacterial reverse mutation test. 1997

5.OECD. Guideline for testing of chemicals No.473：In Vitro mammalian chromosomal aberration test. 2016

6.OECD.   Guideline   for   testing   of   chemicals   No.474 ：Mammalian erythrocyte micronucleus test. 2016

7.OECD.   Guideline   for  testing   of  chemicals  No.  475 ： Mammalian bone marrow chromosome aberration test.    2016

8.OECD. Guideline for testing of chemicals No. 476: In vitro mammalian cell gene mutation tests using the Hprt and xprt genes. 2016

9.OECD. Guideline for testing of chemicals No. 487：In vitro mammalian cell micronucleus test. 2016

10.OECD.  Guideline  for  testing  of  chemicals  No.  488 ：Transgenic rodent somatic and germ cell gene mutation assays. 2013

11.OECD. Guideline for testing of chemicals No. 489：In vivo mammalian alkaline comet assay. 2016

12.OECD. Guideline for testing of chemicals No. 490：In vitro mammalian cell gene mutation tests using the thymidine kinase gene. 2016

六、注释

注释 1：尽管只有少数但仍有一定数量的遗传毒性致癌剂能 被骨髓染色体损伤试验检出，而在标准组合所列出的体外试验中 却得到阴性、弱阳性或相互矛盾的结果。丙卡巴肼、对苯二酚、 氨基甲酸乙酯、 苯等致癌剂即为此类物质。

注释 2：虽然两种标准试验组合同等适合， 但是某些受试物 的特异性信息提示应首选其中一种组合。例如， 如果动物上的全身暴露与预期临床暴露相当或更低，应进行体外试验即组合一； 当预期在肝脏产生短暂的活性代谢物时，推荐采用包含有一项肝 脏体内试验的组合二。

注释 3：某些具有遗传毒性警示结构的化合物被认为与致癌 和/或致突变潜力有因果关系。警示结构包括烷化亲电子中心、 不稳定过氧化物、芳香胺、偶氮结构、 N-亚硝基基团、芳香硝基 基团。

注释 4：对有特殊警示结构的几类化合物， 如含有偶氮基团 的分子、糖苷类、活化需要还原硝基的化合物如硝基咪唑类、代 谢活化需要不同的啮齿类动物 S9 的化合物如非那西汀， 为最适 合检测遗传毒性，采用特殊的方案调整或附加试验是非常重要 的。

注释 5：靶组织： 此处特指体内试验的检测目标组织，如小 鼠骨髓微核试验中的骨髓。

注释 6：采用皮肤和结肠进行诱导微核的体内试验已有一些 经验， 而且在这些组织中进行 DNA 损伤试验也是一种合适的替 代方法。

注释 7：此处所指最高浓度的确定主要针对化学药物， 因中 药、天然药物所包含范围宽且情况复杂， 在合适时可参考化学药 物的最高浓度的确定原则进行设计，不合适时需根据具体情况进 行合理的设计。

注释 8：虽然微核的形成源于受试物与纺锤体相互作用导致 整条染色体分裂的滞后，但微核试验无法检测所有非整倍体诱导 剂。更特异的非整倍体诱导检测方法之一是采用快速、灵敏的技 术分析个体(啮齿类动物)分裂间期核中的染色体，如荧光原位 杂交(FISH) 方法。

注释 9：原则上， 造血细胞的微核可采用任何动物种属的骨髓，以及循环系统中的含微核红细胞不会被脾脏清除的动物种属 的外周血进行评价。在小鼠上， 微核可通过血中的嗜多染红细胞 进行测定，当小鼠持续给药约 4 周或更长时间时也可采用成熟红 细胞进行测定。虽然大鼠可快速清除循环中的含微核红细胞， 但 是大鼠血液网织红细胞中可检测到由一系列断裂剂和非整倍体 剂诱导的微核， 因此大鼠外周血也可用于微核分析，但所采用方 法学需确保能分析新生网织红细胞且方法学经过充分验证。

注释 10：在某些情况下，动物单次或多次给予受试物后取 外周血淋巴细胞进行培养， 可检测中期相染色体畸变， 就如同可 采用骨髓中期相细胞一样。因为循环中的淋巴细胞是不可复制 的，所以该试验系统无法检测需要通过细胞复制才能显示出遗传 毒性作用的受试物(如某些核苷类似物)。由于一些淋巴细胞寿 命相对较长，原则上它们具有体内蓄积未修复 DNA 损伤的潜力， 这使得细胞在体外受到刺激进行分裂时畸变率升高。体内淋巴细 胞试验可用于断裂剂指征的追加研究， 但是，对于造血细胞微核 试验， 采用其他组织(如肝脏)的试验通常可补充提供更多信息 量，因为肝脏中药物和代谢物的暴露通常更高。

注释 11：在标准试验组合中包含第二项体内试验，是为了 通过一种对受试物和/或其代谢物具有良好暴露的组织来确证受 试物不具有遗传毒性。另外，一小部分被认为有遗传毒性的致癌 剂在肝脏试验中结果为阳性，但在体内骨髓细胞遗传学试验中结 果却为阴性。这些案例很可能反映了缺乏合适的代谢活性或缺乏 活性中间体传递至骨髓造血细胞。

注释 12：骨髓是血液灌流性良好的组织，故血液或血浆中 受试物相关物质的水平与骨髓中水平相似。无论何种给药途径， 肝脏对于有全身暴露的受试物预期会有暴露。

注释 13：微核升高可发生于未给予任何遗传毒性物质时，而是由于红细胞生成的干扰(如再生障碍性贫血、髓外造血作 用)、应激、体温偏低或体温过高所致。脾脏功能的改变可影响 含微核细胞从血液中的清除，可导致循环中的含微核红细胞数量 轻微升高。

注释 14：确定微核诱导是否主要由于染色体丢失或染色体 断裂所致，试验应包括对体外或体内微核染色以确定着丝粒是否 存在， 例如， 在着丝粒位置的 DNA 序列采用有探针的荧光原位 杂交(FISH)，或者采用抗着丝粒蛋白的标记抗体。如果大多数 诱导的微核是着丝粒阳性， 这提示有染色体丢失。但是，需要注 意， 强微管毒物如秋水仙碱和长春碱为一种特殊情况， 它们虽然 不会产生 100%着丝粒阳性的微核，但典型的着丝粒阳性微核超 过 70%~80%，而在风险评估中却被公认为主要是非整倍体诱导 剂。一种替代的方法是进行一项体外或体内中期相结构畸变试 验，如果该试验结果是阴性，则提示微核诱导与染色体丢失有关。

注释 15：标准诱导的 S9 混合物比人 S9 具有更高的活化能 力，并且缺乏Ⅱ相解毒能力，除非添加特异性的辅助因子。此外， 在体外测试底物浓度很高时可发生非特异的代谢活化作用。采用 人 S9 或其他人类相关的代谢活化系统进行遗传毒性试验是有用 的。分析遗传毒性试验中培养物的代谢产物特性， 与非临床种属 (非诱导的微粒体或肝细胞，或体内)或来自于人体样本的已知 代谢产物特性进行比较，也可有助于确定试验结果的相关性。而 且，追加试验通常采用肝脏的体内试验。在 S9 存在条件下体外 试验得到阳性结果的受试物，在体内可能不诱导遗传毒性，因为 不形成代谢产物或形成极微量，或被代谢性解毒或快速排泄， 这 种情况可提示缺乏体内风险。

注释 16：小鼠淋巴瘤细胞试验为一种体外哺乳动物细胞 Tk 基因突变试验。除小鼠淋巴瘤 L5178Y  细胞外， 人淋巴母细胞TK6 细胞也可用于检测 Tk 基因位点突变。目前， TK6 试验已纳 入 OECD 指导原则，但是，对于该试验， 目前积累的试验经验 较少， 且未进行充分的方法学验证。在该试验经过充分的方法学 验证后才可用于药物注册目的。

七、附录

推荐的标准试验组合中的遗传毒性试验方法

注：以下方法中所提供的最高浓度和最高剂量设计原则主要 针对化学药物， 中药、天然药物由于情况复杂， 应综合考虑多方 面因素， 不能简单套用该原则， 试验时应根据具体情况进行合理 的设计。

(一)细菌回复突变试验(Bacterial reverse mutation test)

1.菌株

组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌和/或色氨酸营养缺陷型 埃希氏大肠杆菌， 至少应包含下述五种菌株组合(除特殊说明外， 均为鼠伤寒沙门氏菌)：

( 1 ) TA98；(2) TA100；( 3 ) TA1535；(4) TA1537 或 TA97 或 TA97a；( 5 ) TA102 或大肠埃希杆菌WP2 uvrA 或大肠埃希杆 菌 WP2 uvrA (pKM101 )。

菌株特性鉴定需符合要求，  －80C或液氮冻存备用。

2.浓度

至少应包含 5 个可用于结果分析的浓度。

最高浓度主要取决于受试物对细菌的毒性和/或溶解度：

( 1 )对于可溶性的无细菌毒性的受试物，推荐的最高浓度

一般为 5mg/皿(液体受试物为 5µl/皿)。

(2)对于可溶性的有细菌毒性的受试物，应根据细菌毒性 情况确定最高浓度(详见正文 1.2.2)。

(3)对于难溶性的受试物，若未观察到细菌毒性，一般以最小沉淀浓度为评价的最高浓度；若观察到浓度相关性的细菌毒 性或诱变性，则要求检测多个产生沉淀的浓度(详见正文 1.2.3 )。

3.代谢活化

一般采用诱导剂，如 Aroclor 1254 或苯巴比妥和 β-萘黄酮联 合诱导处理后的哺乳动物肝脏微粒体酶(S9)进行体外代谢活化 试验， 即在加 S9 和不加 S9 平行条件下测试。S9 在 S9 混合液中 的浓度一般为 5% ~ 30% (v/v)。

4.对照

代谢活化或非代谢活化条件下，均应设立平行阴性(空白对 照和/或溶剂对照)和阳性对照组。阳性对照物应为已知的菌株 特异性的阳性致突变剂。

5.方法

可采用标准平板掺入法或预培养法，受试物处理后 48 ~ 72 小时观察结果。每一浓度至少平行三皿。

6.结果判定

结果中应描述各浓度组细菌毒性大小和沉淀情况；结果表示 为每皿的回复突变菌落数，并计算各组的均值和标准差。

至少在一个菌株上， 在有或无代谢活化条件下， 受试物所诱 发的回复突变菌落数出现浓度依赖性的增加和/或在一个或多个 浓度组上出现可重复性的增加，可判定为阳性结果。结果判定时 应首先考虑试验结果的生物学意义，统计学分析有助于结果的评 价。

(二)体外哺乳动物细胞染 色体畸变试验( In  vitro mammalian chromosomal aberration test)

1.细胞

       可采用哺乳动物或人的细胞进行试验，如 CHL 细胞、 CHO 细胞、 TK6 细胞、人外周血淋巴细胞等， 细胞系需定期检查核型和有无支原体污染等。 -80C或液氮冻存备用。

2.浓度

       至少应包含 3 个可用于结果分析的浓度。

       最高浓度主要取决于受试物的细胞毒性和/或溶解度。

( 1 )对于可溶性的无细胞毒性的受试物，推荐的最高浓度

       一般为 1 mM 或 0.5 mg/ml   (选用较低者)。

(2)对于可溶性的有细胞毒性的受试物，应根据细胞毒性 大小确定最高浓度。最高浓度所产生的细胞毒性应达到约 50% 但无需超过 50%。对于哺乳动物细胞， 可采用相对群体倍增数 (Relative population doubling，RPD)和相对细胞增长数( Relative increase in cell count，RICC) 的减少来反映细胞毒性； 对培养的 人外周血淋巴细胞，可通过有丝分裂指数( Mitotic Index ，MI) 的降低来反映细胞毒性。

(3)对于难溶性的受试物，一般采用最小沉淀浓度为最高 浓度。

       对最高浓度之下的其他浓度，对于细胞毒性小或无的受试 物，一般浓度间距为 2 ~ 3 倍；对于有细胞毒性的受试物，所选 择的浓度应覆盖产生细胞毒性的范围，并且包括具有中度或少/ 无细胞毒性的浓度； 在一些情况下，如具有较陡峭的浓度反应关 系，则可适当缩小浓度间距或将检测的浓度加至 3 个以上。

       每一浓度一般平行 2 皿；若能获得足够细胞数，可用单皿， 尤其当超过 3 个检测浓度时。

3.代谢活化

       一般采用诱导剂，如 Aroclor 1254 或苯巴比妥和 β-萘黄酮联 合诱导处理后的哺乳动物肝脏微粒体酶(S9)进行体外代谢活化 试验，即在加 S9 和不加 S9 平行条件下测试。S9 在试验介质中 的终浓度一般为 1% ~ 10% (v/v)。

4.对照

       代谢活化或非代谢活化条件下，均应设立平行阴性(空白对 照和/或溶剂对照)和阳性对照组。阳性对照物应为已知的阳性 诱变剂。

5.方法

       处理及细胞收获时间：在代谢活化或非代谢活化条件下，受 试物和细胞作用3~6 小时，在 1.5 个正常细胞周期时收获细胞； 在非代谢活化条件下，受试物和细胞还应持续作用至 1.5 个正常 细胞周期时收获细胞。对于某些受试物，与细胞接触时间/收获 细胞时间可能要大于 1.5 个正常细胞周期。

       读片分析：一般油镜下每种浓度至少观察 300 个分散良好的 分裂中期相细胞，若观察到大量染色体畸变细胞， 分析细胞数可 相应减少。应分别记录各组含有结构畸变染色体的细胞数和畸变 类型，染色单体型与染色体型畸变应分别记录并记录亚型(断裂、 交换)。裂隙应单独记录，但不计入畸变率中。同时应单独记录 多倍体和内复制等数目畸变， 但不计入畸变率中。

6.结果判定

       结果中应描述各浓度组细胞毒性大小和沉淀情况；结果表示 为染色体结构畸变细胞的百分率。

       受试物在任一处理条件下至少一个浓度时染色体畸变率显 著升高， 升高具有浓度依赖性， 且畸变率在阴性对照历史范围之 外， 可判定为阳性结果。结果判定时应首先考虑试验结果的生物 学意义， 统计学分析有助于结果的评价。

       如果结果不是明确的阳性或阴性结果，或者为了帮助确定结 果的生物学意义，应对数据进行专家同行评议和/或进一步研究。 分析更多的细胞(当可行时)，或者通过改变试验条件进行重复 试验(如改变试验浓度间距、改变代谢活化条件等)可能是有用的。

       应单独记录多倍体和内复制的发生率。多倍体数目的增加提 示受试物可能会抑制有丝分裂或诱导染色体数目畸变。出现染色 体内复制的细胞数增多提示受试物可能会影响细胞周期。

(三) 体外小鼠淋巴瘤细胞 Tk  基因突变试验( In  vitro mouse lymphoma cell Tk gene mutation assay ，MLA)

1.细胞

     通常采用小鼠淋巴瘤 L5178Y tk+/- 一3.7.2 C 细胞(注释 16)。 细胞系需定期检查核型或有无支原体污染等，必要时进行自发突 变细胞的清除。 -80C或液氮冻存备用。

2.浓度

      至少应包含 4 个可用于结果分析的浓度。

      最高浓度主要取决于受试物的细胞毒性和/或溶解度：

( 1 )对于可溶性的无细胞毒性的受试物，推荐的最高浓度一般为 1mM 或 0.5mg/ml   (选用较低者)。

(2)对于可溶性的有细胞毒性的受试物，应根据细胞毒性 大小确定最高浓度，最高浓度应能产生 80%~90%的细胞毒性。 通过相对总生长率( Relative total growth ，RTG)来反映细胞毒 性。

(3)对于难溶性的受试物，若无细胞毒性，一般采用最小 沉淀浓度作为最高浓度； 即使细胞毒性出现在最小沉淀浓度以 上，一般建议只检测 1 个沉淀浓度，因为沉淀可能产生干扰。

       对最高浓度之下的其他浓度，对于细胞毒性小或无的受试 物，一般浓度间距为 2 ~ 3 倍；对于有细胞毒性的受试物，所选 择的浓度应覆盖产生细胞毒性的范围，并且包括具有中度或少/ 无细胞毒性的浓度； 在一些情况下，如受试物具有较陡峭的浓度 反应关系，可适当缩小浓度间距或将检测的浓度增加至 4  个以上。

3.代谢活化

       一般采用诱导剂，如 Aroclor 1254 或苯巴比妥和 β-萘黄酮联 合诱导处理后的哺乳动物肝脏微粒体酶(S9)进行体外代谢活化 试验，即在加 S9 和不加 S9 平行条件下测试。S9 在试验介质中的终浓度一般为 1% ~ 10% (v/v)。

4.对照

      代谢活化或非代谢活化条件下，均应设立平行阴性(空白对 照和/或溶剂对照)和阳性对照组。阳性对照物应为已知的阳性 诱变剂。

5.方法

      一般采用微孔法或软琼脂法进行试验。以微孔法为例：

       处理时间：在代谢活化或非代谢活化条件下，一般受试物与 细胞作用 3~4 小时。如果作用3~4 小时后结果为阴性， 还需进 行在非代谢活化条件下作用 24 小时的附加试验。

       突变表达期： 受试物与细胞作用结束后， 去除受试物， 将细 胞重悬于培养液中， 一般 L5178Y 细胞的突变表达期为2 天。分 别在处理结束后及表达期结束后测定平板接种效率以评价细胞 毒性。

       突变率测定： 表达期结束后，将细胞接种于含有突变选择剂 三氟胸苷(TFT)的 96 孔板中进行 TFT 抗性突变集落的测定。 如果受试物出现阳性结果， 需要对至少一个受试物浓度组(一般 为最高浓度)和阴性、阳性对照组分别记录含有大、小集落的孔 数； 如果为阴性结果，仅需要对阴性和阳性对照组分别记录含有 大、小集落的孔数。

6.结果判定

      结果中应描述各浓度组细胞毒性大小和沉淀情况；结果表示为各浓度组的突变率(Mutant frequency ，MF)。

      MLA 试验中阴性对照组和阳性对照组必须符合以下标准才 可判定 MLA 试验成立。

      阳性对照组的突变率、突变选择时的克隆率、悬液增长应满 足以下条件：

                              表 1 MLA 成立的阴性对照组标准

 

参数	软琼脂法	微孔法
突变率(MF)	( 35 ~ 140) ×10-6	( 50 ~ 170) ×10-6
克隆率	65% ~ 120%	65% ~ 120%
悬液增长	8~32 倍(3~4 小时处理) 32 ~ 180 倍(24 小时处理)	8~32 倍(3~4 小时处理) 32~180 倍(24 小时处理)

       阳性对照组应满足以下条件之一：

       ( 1 ) 总突变率绝对增加， 比自发背景突变率增加[即诱导 MF (IMF) ]至少 300×10 -6 ，至少 40%的 IMF 应该在小菌落 MF 中。

        (2)与同期阴性对照组比较，小菌落 MF 增加至少 150×10-6。

        MLA  中突变率的增加具有生物学意义的评价标准为，在任 何一种试验条件下，如果一个或多个浓度组的突变率增加超过总 评价因子( Global evaluation factor ，GEF)(GEF 为诱导突变率， 即高于同期阴性对照的突变率的增加。软琼脂法 GEF 为 90×10-6， 微孔法为 126×10-6 )，且呈浓度依赖性，判定为阳性结果。如果 在所有试验条件下各浓度组的突变率无浓度依赖性增加或突变 率的增加未超过 GEF ，判定为阴性结果。

       如果出现明确的阳性或阴性结果， 不需要重复试验。如果结 果不是明确的阳性或阴性结果，或者为了帮助确定结果的生物学意义，应对数据进行专家同行评议和/或进一步研究。在重复试 验中改变试验条件(如改变试验浓度间距、改变代谢活化条件和 处理时间等)可能是有用的。

       (四)体外哺乳动物细胞微核试验( In vitro mammalian cell micronucleus test)

       1.细胞

       可采用哺乳动物或人的细胞进行试验，如 CHL 细胞、 CHO 细胞、 TK6 细胞、人外周血淋巴细胞等。细胞系需定期检查核型 和有无支原体污染等。 -80C或液氮冻存备用。

       2.浓度

       至少应包含 3 个可用于结果分析的浓度。

       最高浓度主要取决于受试物的细胞毒性和/或溶解度：

       ( 1 )对于可溶性的无细胞毒性的受试物，推荐的最高浓度一般为 1mM 或 0.5mg/ml   (选用较低者)。

        (2)对于可溶性的有细胞毒性的受试物，应根据细胞毒性 大小确定最高浓度。最高浓度所产生的细胞毒性应达到约 50%。 无细胞松弛素 B ( Cyto B)时通过 RICC 、RPD 的减少来反映细 胞 毒 性 ，  有 细 胞 松 弛 素 B   时 通 过 分 裂 阻 滞 增 殖 指 数 ( cytokinesis-block  proliferation  index ， CBPI )或 复 制 指 数 ( Replication index ，RI)来反映细胞毒性。

         (3)对于难溶性的受试物，若无细胞毒性，一般采用最小 沉淀浓度为最高浓度；若细胞毒性出现在最小沉淀浓度以上， 一 般建议只检测 1 个沉淀浓度， 因为沉淀可能产生干扰。

         对最高浓度之下的其他浓度，对于细胞毒性小或无的受试 物，一般浓度间距为 2 ~ 3 倍；对于有细胞毒性的受试物，所选 择的浓度应覆盖产生细胞毒性的范围，并且包括具有中度或少/ 无细胞毒性的浓度； 在一些情况下，如受试物具有较陡峭的浓度反应关系，则可适当缩小浓度间距或将检测的浓度增加至 3 个以上。

        每一浓度一般平行 2 皿；若能获得足够细胞数，可用单皿， 尤其当受试物超过 3 个检测浓度。

3.代谢活化

       一般采用诱导剂，如 Aroclor 1254 或苯巴比妥和 β-萘黄酮联 合诱导处理后的哺乳动物肝脏微粒体酶(S9)进行体外代谢活化 试验，即在加 S9 和不加 S9 平行条件下测试。S9 在试验介质中

的终浓度一般为 1% ~ 10% (v/v)。

4.对照

         代谢活化或非代谢活化条件下，均应设立平行阴性(空白对 照和/或溶剂对照)和阳性对照组。阳性对照物应为已知的阳性 诱变剂。

5.方法

       处理及细胞收获时间：在代谢或非代谢活化的情况下， 受试 物和细胞作用 3~6 小时，加或不加细胞松弛素 B ( Cyto  B)在 1.5~2.0 个正常细胞周期时收获细胞； 在非代谢活化条件下， 加 或不加 Cyto  B 受试物和细胞还应持续作用至 1.5~2.0 个正常细 胞周期时收获细胞。对于某些受试物，与细胞接触时间/收获细 胞时间可能要大于 1.5 个正常细胞周期。

       读片分析：每个浓度应至少观察 2000 个双核细胞(加 Cyto B)或单核细胞(不加 Cyto  B)，分析微核率。应至少观察 500 个细胞， 加 Cyto B 时通过 CBPI 或RI 来评价其细胞毒性， 不加 Cyto B 时通过 RICC 或RPD 来评价细胞毒性。

        也可采用已经过充分验证的自动化分析系统(如流式细胞 术、激光扫描细胞计数仪、图像分析系统) 对微核进行检测。

6.结果判定

          结果中应描述各浓度组细胞毒性大小和沉淀情况；结果表示为微核率。

          受试物在任一处理条件下一个或多个浓度组微核率显著增 加，增加具有浓度依赖性，且微核率在阴性对照历史范围之外， 可判定为阳性结果。结果判定时应首先考虑试验结果的生物学意 义，统计学分析有助于结果的评价。

        如果结果不是明确的阳性或阴性结果，或者为了帮助确定结果 的生物学意义，应对数据进行专家同行评议和/或进一步研究。分 析更多的细胞(当可行时)，或者通过改变试验条件进行重复试验 (如改变试验浓度间距、改变代谢活化条件等) 可能是有用的。

(五)哺乳动物体内微核试验(In vivo mammalian erythrocyte micronucleus test)

1.动物

       骨髓试验通常采用小鼠和大鼠，如合适也可选用其他哺乳动 物。微核也可通过小鼠外周血中未成熟(如嗜多染)红细胞或大 鼠血液新生网织红细胞测定。由于大鼠脾脏可清除血液中的微核 化红细胞，若采用大鼠外周血测定微核， 需采用具有足够灵敏度 的检测方法来测定新生网织红细胞中的微核。

       采用健康年轻性成熟动物，啮齿类动物给药起始年龄建议为 6 ~ 10 周龄。一般情况下雌性和雄性动物微核反应相似， 故可采 用一种性别动物，如雄性。若性别间存在明显的毒性或代谢方面 的差异， 则应采用两种性别的动物，每组可分析的动物数雌雄至 少各 5 只。如果受试物拟专用于一种性别， 可选用相应性别的动 物进行试验。

        起始试验时，动物体重差异应在各性别平均体重的 20%之内。

2.剂量

      至少应设置 3 个剂量组。

      根据相关毒性试验或预试验的结果确定高剂量，高剂量应产生一定的毒性症状(如体重降低、造血系统细胞毒性)或骨髓毒 性(如嗜多染红细胞占红细胞总数的比例降低超过 50%)。如果 受试 物 不 引 起毒 性， 给 药 时 间<14  天 的 推荐 最 高 剂 量 为 2000mg/kg/天，给药时间≥14 天的推荐最高剂量为 1000mg/kg/天。 如果受试物能引起毒性，则最高剂量采用最大耐受量， 且剂量应 优选能覆盖产生最大毒性到少/无细胞毒性的剂量范围。当在所 有剂量均观察到靶组织(骨髓)毒性时， 建议在无毒性剂量下进 一步研究。为更充分地研究剂量-反应曲线的形状可能需要增加 剂量组。

3.对照

       应设立平行阴性(空白对照和/或溶剂对照) 和阳性对照组。 阳性对照物应为已知的阳性诱变剂。

4.方法

       给药方案：根据具体情况选择合适的给药方案， 可采用单次 给药(或一日内以不超过 2 ~ 3 小时间隔分多次给药)或多次给 药(给药间隔为 24  小时)，首选多次给药。受试物的给药途径 应尽可能与临床拟用途径相同，阴性对照物应与受试物给药途径 一致，阳性对照物的给药途径可以不同于受试物。

        采样时间：采样时间根据靶组织中微核出现和消失的动力学 特征确定。

如果采用单次给药， 应至少采样 2 次， 骨髓采样时间应在给 药后24~48 小时内，外周血采样时间应在给药后 36~72 小时内。 受试物第一个采样点应包括所有剂量组， 第二个采样点可仅包括 高剂量组。

        如果给药 2 次(约每 24  小时给药一次)，骨髓采样时间为 末次给药后 18 ~ 24  小时，外周血采样时间为末次药后 36 ~ 48 小时。

        如果给药 3 次及 3 次以上(约每 24  小时给药一次)，骨髓 采样时间为末次给药 24  小时内，外血周采样时间为末次给药后 40 小时内。

       读片分析：每只动物至少计数 500 个(骨髓)或2000 个(外 周血)红细胞以确定未成熟红细胞[嗜多染红细胞(PCE)或网 织红细胞(RET)]占总红细胞[未成熟红细胞和正染红细胞(NCE)] 的比例； 每只动物至少计数 4000 个未成熟红细胞以测定未成熟 红细胞的微核率。若阴性对照历史数据库的微核率背景值低于 0. 1%时， 需要计数更多的未成熟红细胞。给药组未成熟红细胞占 总红细胞的比例不应低于阴性/溶剂对照组的 20%。如果给药时 间在 4 周以上， 可以直接计数 4000 个红细胞中的微核率。

       也可采用已经过充分验证的自动化分析系统(如图像分析系 统、流式细胞术、激光扫描细胞计数仪) 对微核进行检测。当计 数 CD71+未成熟细胞时，给药组未成熟细胞占总红细胞的比例不得低于阴性/溶剂对照组的 5%。

5.结果判定

       结果中应描述各剂量组的毒性大小，包括一般症状、死亡情 况等，以及 PCE/ (PCE+NCE)或 RET/ (RET+NCE)的比例； 结果表示为嗜多染细胞微核率(MNPCE)或网织红细胞微核率 (MNRET)。

       受试物至少一个剂量组微核率显著升高，该增加在至少一个 采样点具有剂量依赖性，且在阴性对照历史范围之外， 可判定为 阳性结果。

       如果结果不是明确的阳性或阴性，或者为了帮助确定结果的 生物学意义(如弱的或边缘性增加)，应对数据进行专家同行评 议和/或进一步研究。有时候需要分析更多的细胞或者改变试验 条件进行重复试验。

(六)体内碱性彗星试验( In vivo mammalian alkaline comet assay)

1.动物

       通常采用健康年轻性成熟的啮齿类动物，给药起始年龄 6 ~ 10 周龄。啮齿类动物种属选择应采用在毒性试验中使用的种属， 致癌性试验中可致肿瘤的种属，或者与人类代谢最相关的种属。 常采用大鼠，如果科学合理也可采用其他种属。

       彗星试验关于雌性动物的试验数据很少，参考其他体内遗传 毒性试验，可采用一种性别进行试验， 如雄性。若性别间存在明 显的毒性或代谢方面的差异，则应采用两种性别的动物，可分析 动物数每组雌雄至少各 5 只。如果受试物拟专用于一种性别， 可 采用相应性别的动物进行试验。

2.剂量

       至少应设置 3 个剂量组。

       根据相关毒性试验或预试验的结果确定高剂量，可采用最大 耐受量(MTD)、最大给药量、最大暴露量或限度剂量为最高剂量。 对于低毒性化合物，给药时间<14 天的推荐最高剂量为2000mg/kg/ 天，给药时间≥14  天的推荐最高剂量为 1000mg/kg/天。最高剂量 之下的剂量以合适的剂量间距递减以研究剂量-反应关系，且剂量 应优选能覆盖产生最大毒性到少/无毒性的剂量范围。当在所有剂 量均观察到靶组织毒性，建议在无毒性剂量下进一步研究。为更 充分地研究剂量-反应曲线的形状可能需要附加剂量组。

3.对照

       应设立平行阴性(空白对照和/或溶剂对照) 和阳性对照组。 阳性对照物应为已知的阳性诱变剂。

4.方法

给药方案：可采用每天给药一次， 给药 2 天或更多天。受试物的给药途径应尽可能与临床拟用途径相同，阴性对照物应与受 试物给药途径一致，阳性对照物的给药途径可以不同于受试物。

        采样： 采样时间对于彗星试验非常关键。采样时间由受试物 达到靶组织中最大浓度所需的时间，以及诱导 DNA 链断裂但在 这些断裂被清除、修复或细胞死亡之前来确定。 彗星试验所能检 测到的引起 DNA 断裂的一些损伤的持续时间可能非常短，因此， 如果怀疑这种短暂的 DNA 损伤， 应采取措施确保组织被尽早采 样，以减少这种丢失。 若可获得，应由药动学数据[如血浆或组 织浓度达峰时间(Tmax )或多次给药后达到稳态浓度]来确定采样 时间。若无药动学数据， 采样时间在 2 次或更多次给药的末次给 药后的 2~6 小时， 或单次给药后的2~6 小时和 16~26 小时两 个时间点。若可获得，靶器官毒性作用表现也可用于选择合适的 采样时间。

       应明确说明组织选择的合理性，组织选择应根据进行该项试 验的理由、受试物已有的药动学(ADME) 信息、遗传毒性、致 癌性和其他毒性信息等来确定，考虑的重要因素包括受试物的给 药途径、预测的组织分布和吸收、代谢的作用、可能的作用机制 等。由于肝脏是外源性代谢的主要部位且常常高暴露于受试物和 其代谢产物，在缺乏背景信息且未确定特殊关注组织的情况下， 可选择肝脏作为研究组织。在一些情况下， 可选择受试物直接接 触部位进行研究。

       样品处理：样品处理过程极为关键，应严格控制试验条件， 进行充分的方法学验证。取所选择组织， 制备单细胞悬液，单细 胞制备后尽快完成制片(理想的是 1 小时内)。所有玻片的裂解 条件应保持恒定，低温(约 2 ~ 8C)避光裂解至少 1 小时(或 过夜)。强碱条件下(pH≥13)，解旋至少 20 分钟，在控制条件 下进行电泳。电泳的电压应保持恒定， 其他参数的变异应保持在狭窄和特定的范围内；解旋和电泳过程中应维持低温(通常为2 ~ 10C )。

       读片分析：采用自动化或半自动化图像分析系统进行阅片， 对彗星进行定量评价。

       细胞可分为三类：可评分细胞、不可评分细胞和刺猬样细胞(hedgehog)。

       对可评分细胞(具有清晰的头部和尾部，不干扰邻近细胞) 的尾 DNA  百分率[%  tail  DNA，也称尾强度百分率( %  tail intensity) ]进行评价， 来反映 DNA 链断裂。每个动物样本应至 少对 150 个可评分细胞进行测定。

       刺猬样细胞是严重损伤的细胞，无法通过图像分析系统进行 可靠测量， 应单独评价刺猬样细胞。每个动物样本应至少对 150 个细胞进行观察并单独记录， 计算刺猬样细胞百分率。

5.结果判定

       结果中应描述各剂量组的毒性大小，包括一般症状，以及刺 猬样细胞百分率。结果表示为各剂量组的尾 DNA 百分率( %tail DNA)(首选指标)、尾长或尾矩。

       除了遗传毒性外，靶组织毒性也可导致 DNA 迁移增加，故 结果分析时需区分遗传毒性和细胞毒性。可通过组织病理学变化 来反映细胞毒性，如炎症、细胞浸润、凋亡或坏死性变化与 DNA 迁移增加有关， 血液生化学指标的改变(如 AST 、ALT  等)也 可提供细胞毒性的信息。

       受试物所诱发的尾 DNA 百分率与同期阴性对照组相比至少 一个剂量组显著升高、升高具有剂量依赖性，且在阴性对照历史 范围之外，可判定为阳性结果。

        如果结果不是明确的阳性或阴性，或者为了确定阳性结果的 生物学意义， 应进行专家同行评议和/或进一步研究，如分析更多的细胞(当可行时)，或者采用优化的试验条件进行重复试验 (如改变试验剂量间距、其他给药途径、其他采样时间或其他组 织)。

        对于阴性结果，需提供支持靶组织暴露或毒性的直接或间接 证据。为评价阳性或可疑结果的生物学意义，需提供靶组织细胞 毒性信息。