GLP认证咨询-药物遗传毒性研究技术指导原则

药物遗传毒性研究技术指导原则

一、概述

       遗传毒性研究(Genotoxicity Study) 是药物非临床安全性评 价的重要内容， 与其他研究尤其是致癌性、生殖毒性等研究有着 密切的联系， 是药物进入临床试验及上市的重要环节。拟用于人 体的药物，应根据受试物拟用适应症和作用特点等因素考虑进行 遗传毒性试验。

       遗传毒性试验是指用于检测通过不同机制直接或间接诱导 遗传学损伤的受试物的体外和体内试验，这些试验能检测出 DNA 损伤及其损伤的固定。以基因突变、较大范围染色体损伤 或重组形式出现的 DNA 损伤的固定， 通常被认为是可遗传效应 的基础， 并且是恶性肿瘤多阶段发展过程的重要因素(恶性肿瘤 发展变化是一个复杂的过程，遗传学改变可能仅在其中起部分作 用)。染色体数目的改变也与肿瘤发生有关，并可提示生殖细胞 出现非整倍体的可能性。在遗传毒性试验中呈阳性的化合物为潜 在的人类致癌剂和/或致突变剂。由于在人体中已建立了某些致 突变/遗传毒性化合物的暴露与致癌性之间的相关性，而对于遗 传性疾病尚难以证明有类似的相关性，因此遗传毒性试验主要用 于致癌性预测。但是，因为生殖细胞突变与人类疾病具有明确的 相关性，所以也应同样重视化合物引起潜在可遗传性效应的风 险。此外，遗传毒性试验结果可能对致癌性试验的结果分析有重 要作用。因此，在药物开发的过程中， 遗传毒性试验的目的是通 过一系列试验来预测受试物是否有遗传毒性，在降低临床试验受试者和药品上市后使用人群的用药风险方面发挥重要作用。

       本指导原则重点阐述遗传毒性试验的基本原则，介绍标准试 验组合方案， 阐述体内外试验的基本原则， 以及对试验结果的分 析评价与追加研究策略。

       本指导原则适用于中药、天然药物和化学药物。

二、基本原则

(一)实验管理

      药物遗传毒性试验必须执行《药物非临床研究质量管理规 范》( GLP)。

(二)具体问题具体分析

       遗传毒性试验的设计，应该在对受试物认知的基础上， 遵循 “具体问题具体分析”的原则。应根据受试物的结构特点、理化性 质、已有的药理毒理研究信息等选择合理的试验方法， 设计适宜 的试验方案，并试验结果进行全面的分析与评价。

(三)随机、对照、重复

      遗传毒性试验应符合毒理学试验随机、对照、重复的基本原 则。

三、基本内容

(一)受试物

       中药、天然药物：受试物应采用能充分代表临床试验拟用样 品和/或上市样品质量和安全性的样品。应采用工艺路线及关键 工艺参数确定后的工艺制备，一般应为中试或中试以上规模的样 品，否则应有充分的理由。

       化学药物：受试物应采用工艺相对稳定、纯度和杂质含量能反映临床试验拟用样品和/或上市样品质量和安全性的样品。

       受试物应注明名称、来源、批号、含量(或规格)、保存条 件、有效期及配制方法等， 并提供质量检验报告。试验中所用溶媒和/或辅料应标明名称、标准、批号、有效期、规格和生产单 位等，并符合试验要求。

       应进行受试物样品分析，并提供样品分析报告。

       在药物研发的过程中，若受试物的工艺发生可能影响其安全 性的变化，应进行相应的安全性研究。

(二)标准试验组合

       对药物而言，需对潜在的遗传毒性进行全面评价。

       遗传毒性试验方法有多种，根据试验检测的遗传终点， 可将 检测方法分为三大类， 即基因突变、染色体畸变、 DNA 损伤； 根据试验系统， 可分为体内试验和体外试验。由于没有任何单一 试验方法能检测出所有的与肿瘤发生相关的遗传毒性机制， 因 此，通常采用体外和体内试验组合的方法，以全面评估受试物的遗 传毒性风险。这些试验相互补充，对结果进行判断时应综合考虑。

1.标准试验组合应具备的特征

         标准试验组合应反映不同遗传终点，包括体内和体外试验， 应包含以下内容：

        ( 1 ) 应包含细菌回复突变试验(又称 Ames 试验)。该试验 已证明能检出相关的遗传学改变和大部分啮齿类动物和人类的 遗传毒性致癌剂。

        (2)应包含哺乳动物细胞体外和/或体内试验。

       哺乳动物细胞体外试验中，体外中期相染色体畸变试验、体 外微核试验、体外小鼠淋巴瘤 L5178Y 细胞 Tk 基因突变试验(简 称小鼠淋巴瘤细胞试验， MLA) 已经过充分验证并广泛应用， 且同样适合于检测染色体损伤。若实验室对这些方法已进行了充 分的验证，当用于标准试验组合中时，这几个试验可互相替换。

       体内试验具有考虑到如吸收、分布、代谢、排泄等因素的优 势，并且可检出体外试验无法检出的某些遗传毒性物质(注释 1 )，因此标准试验组合应至少包含一项体内试验。可采用啮齿类动物 造血细胞染色体损伤试验(包括骨髓或外周血红细胞微核试验、 骨髓中期相细胞染色体畸变试验) 或其他合适的体内试验。

2.推荐的两种标准试验组合

组合一：

( 1 )一项细菌回复突变试验；

(2)一项检测染色体损伤的体外细胞遗传学试验(体外中 期相染色体畸变试验或体外微核试验)，或一项体外小鼠淋巴瘤 细胞 Tk 基因突变试验；

(3)一项体内遗传毒性试验，通常为啮齿类动物造血细胞 染色体损伤试验，用于检测微核或中期相细胞染色体畸变。

组合二：

( 1 )一项细菌回复突变试验；

(2)采用两种不同组织进行的体内遗传毒性试验，通常为 一项啮齿类动物造血细胞微核试验和第二项体内试验。

以上两种试验组合同等适合(注释 2)，可根据受试物特点 自主选择。

       体内试验可采用单次给药或重复给药的试验设计。如果试验 设计科学合理，采用重复给药时可将遗传毒性终点指标整合入一 般毒性试验中； 当在体内评价一项以上的遗传毒性终点指标时， 也可将它们整合在一项试验中。但是， 整合的前提条件是试验设 计(例如剂量、采样) 对于重复给药试验是合适的，并且需要获 得充分的支持信息。

       完成上述任何一种标准试验组合， 若试验结果为阴性， 通常 可提示受试物不具有遗传毒性。对于标准试验组合结果为阳性的 受试物， 根据其治疗用途，可能需要进一步的试验。

       标准试验组合不包含为检测非整倍体而设计的特定试验。但是，检测中期相细胞染色体畸变的体外和体内试验可检测多种类 型的染色体完整性方面的改变，微核试验具有检测某些非整倍体 诱导剂的能力， 小鼠淋巴瘤细胞试验也可检测染色体丢失(可能 导致非整倍体)。

       建议采用标准试验组合并不意味着其他遗传毒性试验不合 适， 这些试验可作为标准试验组合以外的供选试验，用于对标准 试验组合得到的遗传毒性试验结果的进一步研究。在某些情况 下，标准试验组合中的一项或多项试验对于受试物不适合或因技 术原因无法实施时，可采用其他经过验证的试验作为替代试验， 但应提供充分的科学合理性及依据。

       附录部分简介标准试验组合中常用的几种试验方法，该部分 内容只是基本原则，试验时应根据具体情况具体分析，合理设计。

3.标准试验组合的调整

       标准试验组合在一些特殊情况下不适合， 需要根据情况进行 调整。

( 1 )当受试物对细菌有高毒性时(如某些抗生素)，仍应进 行细菌回复突变试验，因为致突变性可能出现在较低的、毒性较 小的浓度。同时，还应进行一项体外哺乳动物细胞试验， 即采用 标准试验组合一。

(2)标准试验组合通常可检出具有遗传毒性作用警示结构 的受试物(注释 3)，因为大部分“警示结构”被定义为与细菌诱 变性有关。但是，对于具有某些特殊警示结构的化合物， 需要对 标准组合方案进行调整(注释 4)。附加试验的选择或方案的调 整取决于这些具有警示结构受试物的化学性质、已知活性和代谢 信息。

( 3 )某些特殊的受试物，如一些放射影像剂、抗酸铝合剂、 一些吸入用药、一些皮肤或其他局部用药， 毒代或药代动力学研究提示其不被全身吸收，因此在体内遗传毒性试验中无法到达靶 组织(注释 5)。对于这些受试物，体内试验(尤其是骨髓、血 液、肝脏)难以提供有用的信息。在改变给药途径也不能提供足 够的靶组织暴露，且对暴露量最高的组织无合适的遗传毒性试验 的情况下， 仅根据体外试验进行评价可能是合适的。某些情况下， 采用接触部位评价遗传毒性作用可能也是合理的，尽管这些试验 尚未广泛应用(注释 6)。

4.生殖细胞诱变剂的检测

       遗传毒性对生殖细胞的影响也极其重要。标准试验组合中不 包含专门检测生殖细胞诱变剂的试验。但是， 比较研究结果显示， 从定性的角度， 大多数生殖细胞诱变剂能在体细胞试验中检出， 因此体内体细胞遗传毒性试验的阴性结果通常可提示受试物对 生殖细胞无影响。体内体细胞试验结果为阳性时，在综合评价及 指导用药时应关注受试物对生殖细胞的影响。

(三)体外、体内试验基本要求

      遗传毒性的体内外试验方法较多，本指导原则仅讨论常用方 法及需要重点关注的问题，试验时需具体情况具体分析。

      无论体外、体内试验，方法学均应经过充分验证。各实验室 应建立历史背景对照数据库(包括阴性和阳性对照数据库)。

1.体外试验基本要求

1.1  细菌回复突变试验中采用的菌株

      细菌回复突变试验至少应采用 5 种菌株，包括用于检测组氨 酸靶基因中鸟嘌呤-胞嘧啶(G-C) 位点碱基置换或移码突变的 4 种组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌( TA98；TA100；TA1535； TA1537/TA97/ TA97a)，以及用于检测组氨酸或色氨酸基因中腺 嘌呤-胸腺嘧啶(A-T)位点碱基置换与检测交联剂的鼠伤寒沙门 氏菌 TA102  或埃希氏大肠杆菌 WP2  uvrA  或埃希氏大肠杆菌WP2 uvrA   (pKM101 )。

1.2  体外试验中最高浓度的确定(注释 7)

      体外试验中受试物的最高浓度主要取决于受试物对细菌/细 胞的毒性和溶解度。

1.2.1 最高浓度

      对不受溶解度或细胞毒性限制的受试物，细菌回复突变试验 应达到的最高浓度为 5mg/皿(液体受试物为5µl/皿)，哺乳动物 细胞试验为 1mM  或 0.5mg/ml (选用较低者)。

1.2.2 要求达到的细胞毒性水平

       在遗传毒性体外试验中，某些遗传毒性致癌剂只有在检测浓 度高达可产生一定程度的细胞毒性时才可检出，但毒性过高又会 影响对相应的遗传终点进行恰当的评价。当哺乳动物细胞存活率 很低时， 一些遗传毒性以外的作用机制如细胞毒性(如与细胞凋 亡、溶酶体释放核酸内切酶等有关的结果)会导致遗传毒性假阳 性结果， 这种情况常发生于受试物浓度达到毒性阈浓度时。

        鉴于以上情况， 在体外细菌和哺乳动物细胞试验中，目前可 接受以下的细胞毒性水平(浓度不应超过 1.2.1 中的规定)：

( 1 )细菌回复突变试验中，进行评价的浓度应能显示明显 的毒性， 如回复突变菌落数目减少、背景菌苔减少或消失。

(2)哺乳动物细胞体外遗传学试验中，最高浓度产生的细 胞毒性应约为 50%。

(3)对于小鼠淋巴瘤细胞 Tk 基因突变试验，最高浓度产生

的细胞毒性应为 80% ~ 90%。

1.2.3 难溶受试物的检测

        用细菌和哺乳动物细胞遗传毒性试验检测某些受试物时，在 不溶解的浓度范围内也能检测出剂量相关性的遗传毒性。建议采 用以下策略检测相对不溶的受试物：

( 1 )对于细菌回复突变试验，如果沉淀不干扰计数，应对 产生沉淀的浓度进行计数， 且最高浓度不超过 5mg/皿或5µl/皿。 当未观察到细菌毒性时，应以产生沉淀的最低浓度作为计数的最 高浓度； 当观察到剂量相关的细菌毒性或诱变性时，应按上述细 胞毒性的要求来确定最高浓度。

(2)对于哺乳动物细胞试验，若沉淀不干扰计数，最高浓 度应是培养液中产生最少可见沉淀的最低浓度。应通过肉眼观察 或镜检等方法来观察记录沉淀在培养过程中持续存在或培养过 程中出现( 至处理结束时)。

1.3  体外试验的重现性

       体外试验应关注重现性。当采用新方法或试验出现非预期结 果时， 有必要进行重复试验。但是，当采用标准的、已广泛应用 的常规体外试验方法时，若这些试验经过了充分验证且进行了有 效的内部质量控制， 得到明确的阳性或阴性结果， 通常不需要重 复试验。但是， 若得到可疑结果， 则需要进一步试验。

2.体内试验基本要求

2.1  检测染色体损伤的体内试验

       采用骨髓细胞分析染色体畸变或检测含微核的嗜多染红细 胞的体内试验方法均可用于检测染色体断裂剂。由于细胞分裂后 期的一个或多个染色体相对滞后也能形成微核，因此微核检测方 法也能检测一些非整倍体诱导剂(注释 8)。

       大鼠和小鼠均适用于骨髓微核试验。微核也可通过小鼠外周 血中未成熟红细胞(如嗜多染红细胞)或大鼠血液新生网织红细 胞测定(注释 9)。同样，也可使用已证明了对检测断裂剂/非整 倍体诱导剂具有足够灵敏度、来源于其他种属动物的骨髓或外周 血的未成熟红细胞。除人工镜检方法外， 若方法学经过了充分验 证，也可采用自动化分析系统(如图像分析系统和流式细胞术)对微核进行检测。

       啮齿类动物给药后， 取外周血淋巴细胞进行体外培养， 也可 用于分析染色体畸变(注释 10)。

2.2  其他体内遗传毒性试验

       第二项体内试验可作为第二种标准试验组合的一部分，并可 用作追加试验以在评价体外或体内试验结果时提高证据权重(注 释 11 )。体内组织和试验的选择应根据多种因素来确定， 例如受 试物可能的作用机制、体内代谢特征或者被认为是相关的暴露组 织等信息。由于肝脏的暴露和代谢能力， 肝脏是代表性的首选组 织。第二种体内试验经常以评价 DNA 损伤为终点指标作为替代 终点。目前，已有大量应用经验的试验包括：DNA 链断裂试验 如单细胞凝胶电泳试验(彗星试验)和碱洗脱试验、转基因小鼠 体内突变试验、 DNA 共价结合试验。

2.3  体内试验的给药途径

      一般情况下，给药途径应与临床拟用途径一致。若不一致， 应说明理由。但是， 为获得全身暴露， 在适当时可进行调整， 如 局部给药的受试物。

2.4  体内试验啮齿类动物性别的选用

       短期给药(通常是给药 1 ~ 3 次) 的体内遗传毒性试验一般 可单用雄性动物。若已有的毒性、代谢或暴露资料提示在所用动 物种属上存在毒理学意义的性别差异，则应采用两种性别的动 物。

       当遗传毒性试验整合在重复给药毒性试验中时，应对两种性 别动物进行采样，如果毒性、代谢方面没有明显性别差异，可仅 对单一性别进行评价。

       如果受试物拟专用于单一性别，可选用相应性别的动物进行试验。

2.5  体内试验的剂量选择(注释 7)

       通常应对有代表性的三个剂量水平进行分析检测。

       对于短期试验(通常是给药1~3次)，推荐的最高剂量是： 限度剂量2000mg/kg(若可耐受)，或最大耐受量(为产生毒性的 剂量，而基于同样的给药方案， 比该剂量稍高即预期会出现死 亡)。剂量选择时还应考虑骨髓红细胞生成的抑制。最高剂量之 下的其他剂量一般剂量间距为约2~3倍。

       对于多次给药试验，分为两种情况：

( 1 )当采用标准试验组合一时，若该试验整合在重复给药 毒性试验中，如果该重复给药毒性试验符合支持人体临床试验的 一个充分试验的标准，则通常认为对于遗传毒性评价剂量是合适 的，该原则适用于体外哺乳动物细胞试验结果为阴性或不相关的 阳性时。

(2)当进行追加试验或当采用标准组合二时，应对多种因 素进行评价以确定高剂量是否适合用于遗传毒性评价。毒性试验 (尤其是大鼠试验)的高剂量需满足以下任何一条标准，才可用 于遗传毒性评价：

①最大给药量， 基于受试物在溶剂中的理化性质。

②对于给药14天或更长时间的试验，如果能耐受，限度剂量

为1000 mg/kg。

③最大可能暴露量，通过达到暴露峰值/稳态或受试物的蓄 积来证明。若受试物的暴露量随给药时间增加而明显减少(如比 起始暴露量减少≥50%)，则不宜采用多次给药试验。

④高剂量≥急性给药试验所采用高剂量的50%，即接近最小 致死量。

           仅基于无毒性的暴露范围(高于临床暴露量的若干倍)来选 择高剂量，不是充分合理的。

           对于具有血液或骨髓毒性的受试物，进行遗传毒性评价的剂 量应在具有严重红细胞系毒性(如具有明显的嗜多染红细胞或网 织红细胞抑制) 的高剂量之下、间距不超过约 2 倍。

(四)试验的阶段性

       细菌回复突变试验可支持单次给药的临床试验；为支持多次 给药的临床试验，应采用哺乳动物细胞进行一项评估染色体损伤 试验；在Ⅱ期临床试验开始前完成完整的遗传毒性标准试验组 合。

       但是， 为了减少药物开发风险、保护受试者安全， 建议在临 床试验开始前完成遗传毒性标准试验组合。